柱式植物葉綠體提取試劑盒 (微量樣品)
|
產品編號
|
產品名稱
|
包裝
|
|
RTU5004
|
柱式植物葉綠體提取試劑盒
|
50次
|
● 產品簡介：
葉綠體（Chloroplast）是質體的一種, 是高等植物和一些藻類所特有的能量轉換器，是光合作用的反應場所。在高等植物中葉綠體為雙凸或平凸透鏡，長徑5~10μm，短徑2~4μm，厚2~3μm。高等植物的葉肉細胞一般含50～200個葉綠體，可占細胞質的40%，葉綠體的數目因物種細胞類型，生態環境，生理狀態而有所不同。葉綠體由葉綠體外被(chloroplast envelope)、類囊體(thylakoid)和基質(stroma)三部分組成，含有3種不同的膜：外膜、內膜、類囊體膜和3種彼此分開的腔：膜間隙、基質和類囊體腔。本公司的植物葉綠體提取試劑盒采用密度梯度離心方法，可以從多種植物中提取高純度的葉綠體。
1.
即用型試劑盒，用戶不需要單獨配制各種溶液。
2.
不需要液氮研磨葉片，可以從50-100
mg材料中提取葉綠體，方便使用。
3.
試劑盒可以用于葉綠體粗提，所得葉綠體含少量其他細胞器污染，可用于后續的SDS-PAGE，Western，ELISA和蛋白組分析。也可以用于葉綠體精提，所得葉綠體完整，可用于后續的光合作用，電子鏈和磷酸化，跨膜轉運，體外葉綠體蛋白合成，蛋白定位等研究。還可用于葉綠體膜，基質，類囊體的提取以及葉綠體DNA和葉綠體RNA純化。
4.
以每次處理0.1
g葉片計算，本產品可使用50次提取，每次能得到20-30
μg葉綠體（葉綠素定量）。
5.
已經成功用于擬南芥，綠蘿，菠菜，大豆，萵筍，白菜，煙草和甜菜等植物，還可用于更多植物（可能需要優化條件）。
注：本產品適合于少量葉片（50-100 mg）葉綠體的提取，大量葉片葉綠體提取（每次處理30
g葉片）請選擇RTU5001
植物葉綠體提取試劑盒。
● 貯存及運輸：
4-8℃保存；有效期一年；試劑盒常溫運輸。
● 產品組成：
|
產品貨號
|
產品名稱
|
包裝
|
貯存
|
|
RTU5004-01
|
提取緩沖液
|
25
ml
|
4-8℃
|
|
RTU5004-02
|
漂洗緩沖液
|
100
ml
|
4-8℃
|
|
RTU5004-03
|
密度梯度分離試劑
|
20
ml
|
4-8℃
|
|
CD-50
|
離心柱套裝（包含離心柱和2 ml連蓋收集管）
|
50套
|
RT
|
|
YMB-5
|
塑料研磨棒
|
5根/包
|
RT
|
|
|
說明書
|
一份
|
-
|
● 使用說明：
注意：葉綠體對溫度高度敏感，所以整個操作必須在冰上或者在冷室進行，所用器皿和溶液均需要在4℃預冷。離心時一定要在4℃進行，離心力以g而不是rpm計算。如果需要研究葉綠體的功能，提取過程還需要在昏暗的光線條件下進行。
需要自備材料：
剪刀；1.5 離心管；低溫離心機。
一 葉綠體提取：
1.1 材料預處理：
實驗前1-2天將植物放在暗室培養以減少葉綠體中淀粉顆粒的形成，否則離心時這些顆粒很容易使葉綠體破裂。葉片在實驗前需先用自來水洗凈，再用蒸餾水淋洗，去掉多余水分。如果葉片采集后不能立即處理，則保存時需要保持葉片濕潤，即使如此，葉片采集后的放置時間也不能超過一天。
1.2 葉片研磨：
1.2.1 取50-100 mg新鮮采集植物樣品（葉片，軟莖等），剪成1-3 cm2大小的碎片放入離心柱內。
注：樣品質量盡量控制在100 mg以內，有利于后續充分研磨。
1.2.2 加入0.1 ml 預冷的提取緩沖液，用塑料研磨棒向下擠壓旋轉研磨樣品20-30次（大約用時1-2分鐘），至樣品無可見大塊組織碎片，再補加0.3 ml 提取緩沖液，用吸頭混勻。
注：塑料研磨棒可以水洗后重復使用。
1.3 離心去雜質：
蓋好2 ml收集管管蓋，4℃ 2000 g（約4600 rpm）離心 5分鐘。
1.4 粗葉綠體提取：
1.4.1 棄離心柱，吸頭吸棄離心管內上清，保留沉淀。
注：如沉淀離心后不實，可以重懸沉淀后再次離心收集沉淀。
1.4.2 沉淀中加入0.1 ml漂洗緩沖液，輕輕重懸，溶液即為葉綠體粗提液。
注：100 mg葉片提取的粗葉綠體，溶于0.1
ml漂洗緩沖液中，葉綠體濃度約為0.6-1
μg Chl/μl（葉綠體濃度測定見步驟1.6），可以將多管葉綠體溶液4℃ 4200 g 離心5分鐘，合并葉綠體沉淀，用漂洗緩沖液將葉綠體濃度調整為 1 μg Chl/μl（1 mg Chl/ml），分裝為50
μl每只，-80℃貯存。
1.5 精制葉綠體提取：
1.5.1即用型梯度分離液配制：
在干凈的1.5 ml離心管中加入0.4 ml 密度梯度分離試劑和0.6
ml漂洗緩沖液，渦旋徹底混勻。
1.5.2 將步驟1.4.2的0.1 ml葉綠體粗提液緩慢加入到即用型梯度分離液上方。
1.5.3 4℃ 4200 g（約6600 rpm）離心10分鐘，小心棄上清，沉淀為精制葉綠體。
1.5.4 在沉淀中加入0.5 ml 漂洗緩沖液，輕柔重懸沉淀。
1.5.5 4℃ 4200 g（約6600 rpm）離心5分鐘，棄上清，保留沉淀。
1.5.6沉淀中加入0.1 ml漂洗緩沖液，輕輕重懸，溶液即為精制葉綠體。
注：100
mg葉片提取的精制葉綠體，溶于0.1
ml漂洗緩沖液中，葉綠體濃度約為0.3-0.7
μg Chl/μl（葉綠體濃度測定見步驟1.6），可以將多管葉綠體溶液4℃ 4200 g 離心5分鐘，合并葉綠體沉淀，用漂洗緩沖液將葉綠體濃度調整為 1 μg Chl/μl（1 mg Chl/ml），分裝為50
μl每只，-80℃貯存。
1.6 葉綠素含量測定：
通常葉綠體含量用單位葉綠素（Chl）含量來表示，即x
mg Chl/ml 葉綠體懸浮液。
1.6.1 取10 μl 葉綠體懸浮液加入到990
μl 95%乙醇溶液中，混勻。
1.6.2測定OD649和OD665 吸光值，用95%乙醇做空白對照。
1.6.3 根據以下公式計算葉綠素：
葉綠素濃度（mg/ml）=100×（18.16×OD649+6.63×OD665）
100：稀釋倍數
二. 葉綠體的使用：
2.1 葉綠體功能研究：
如果用于完整葉綠體的功能或酶活性研究，初始100 mg樣品分離得到的葉綠體樣品調整葉綠體濃度為1 μg Chl/μl，50 μl/管分裝， -80℃貯存備用。不建議長期貯存，盡快使用。
2.2 葉綠體蛋白電泳：
2.2.1葉綠體蛋白變性樣品處理：
2.2.1.1 取50 μl葉綠體溶液（1 μg Chl/μl）；
2.2.1.2 4℃ 4200g 離心5分鐘，棄上清，沉淀中加入SDS-PAGE上樣緩沖液（貨號：PL080，PL113，PL121）處理，建議調整上樣液濃度為0.5 μg/μl；對于多次跨膜蛋白（Multi-pass
membrane protein）的變性電泳檢測，樣品建議使用37℃處理30分鐘，不要95℃加熱5分鐘，因為在95℃高溫情況下，多次跨膜蛋白極易聚集形成多聚體，樣品會聚集，WB檢測會表現為比實際蛋白大小更大的分子量；
2.2.1.3 使用SDS-PAGE凝膠（貨號：RTD6132，RTD6116）電泳，每個泳道上樣10-40 μl（5-20 μg）。
2.2.2 葉綠體蛋白BN非變性樣品處理：
2.2.2.1取50 μl葉綠體溶液（1 μg Chl/μl）；；
2.2.2.2 4℃ 4200g 離心5分鐘，棄上清，沉淀中加入50 μl 類囊體膜增溶緩沖液，輕柔重懸沉淀，盡量不產生氣泡，冰浴10分鐘；
2.2.2.3 4℃ 16000 g 10分鐘，取上清至一干凈1.5 ml離心管中即為增溶后葉綠體蛋白溶液（小心不要吸取沉淀），此時得到的葉綠體蛋白濃度為1 μg/μl，其中去垢劑DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM， n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷）終濃度為2%；
2.2.2.4 葉綠體蛋白溶液中加入1/10體積類囊體膜上樣緩沖液（10×），使用BN凝膠電泳（貨號：RTD6139，RTD6140），每個泳道上樣5-20 μg。
2.2.3 葉綠體蛋白等電聚焦樣品處理（2D凝膠第一維電泳）：
建議葉綠體沉淀中使用溶解液：7 M尿素，2 M硫脲，2%CHAPS，20 mM DTT(自備，試劑盒不提供)。
三 實驗示例：
程序：取0.1克新鮮綠蘿葉片加入到離心柱內，加入0.1 ml提取緩沖液，研磨20次，再加入0.3
ml提取緩沖液（平行做6管）；4度 2000g
離心5分鐘；棄上清，沉淀中加入0.1ml漂洗緩沖液，合并6管得到0.6
ml粗葉綠體，保留0.2ml粗葉綠體。取0.1ml粗葉綠體加到1ml即用型梯度分離液上層（0.4
ml密度梯度分離試劑加0.6ml漂洗緩沖液），平行做4管；4度 4200g
離心10分鐘，棄上清，沉淀中加入0.5ml漂洗液清洗一次，4度 4200g
離心5分鐘，4管精制葉綠體沉淀合并收集于0.1ml漂洗液中。用乙醇方法測定葉綠體濃度，調整粗葉綠體和精制葉綠體濃度均為1μg Chl/μl；取50μl葉綠體溶液，離心，沉淀中加入50
μl類囊體膜增溶緩沖液，冰浴10分鐘，4度
16000g 離心10分鐘取上清，加入1/10體積類囊體膜上樣緩沖液（10×），此時葉綠體蛋白濃度為1μg/μl，上樣10 μl和20 μl。
電泳：RTD6138-0312 3-12%BN膠，1×BN
buffer+0.02%G-250，200V 15-3.5mA 50 min
更換1×無色BN buffer 200V繼續電泳，時間共103
min，FastBlue蛋白染色液染色30分鐘。